一、实验目的

本实验旨在运用博清生物科技（南京）有限公司研发生产的荧光定量PCR仪，探究在不同药物浓度处理下，细胞中特定基因的表达水平变化，从而分析药物对该基因表达的调控作用，为进一步研究药物作用机制及潜在的临床应用提供实验依据。

二、实验设计

（一） 实验材料

1、细胞系：选取人源肺癌细胞系A549，该细胞系在体外培养条件下生长状态良好，可用于研究肿瘤相关基因表达。

2、药物：选择新型抗肿瘤药物X，将其配置成0μM（对照组）、1μM、5μM、10μM四种不同浓度梯度的溶液，以探究药物浓度与基因表达的关系。

3、试剂：RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green 荧光定量PCR预混试剂、无RNA酶水、引物（针对目标基因及内参基因GAPDH设计合成）。

4、仪器：荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、涡旋振荡器、微量分光光度计。

（二）样本分组与处理

将培养的A549细胞均匀分为4组，每组设置3个生物学重复。分别用不同浓度的药物X处理细胞，对照组仅加入等量的溶剂（0.1%DMSO），在37℃、5% CO₂的恒温培养箱中孵育24小时后，收集细胞用于后续实验。

三、实验操作步骤

（一） RNA提取

1、在超净工作台中，弃去细胞培养板中的培养基，用预冷的 PBS 缓冲液轻轻洗涤细胞2次，以去除残留的培养基成分。

2、每孔加入1ml TRIzol试剂，用枪头反复吹打细胞，使细胞充分裂解，室温静置5分钟，以确保RNA充分释放。

3、将裂解液转移至1.5ml无RNA酶的离心管中，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置2 - 3分钟，使有机相和水相充分分层。

4、4℃、12000rpm离心15分钟，此时离心管中会出现三层，上层无色水相含有RNA，中间层为白色蛋白层，下层为红色有机相。小心吸取上层水相至新的离心管中，避免吸到中间层和下层液体，以防RNA污染。

5、加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置10分钟，使RNA沉淀。

6、4℃、12000rpm离心10分钟，弃去上清液，此时可见管底有白色沉淀，即为RNA。

7、加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃、7500rpm离心5分钟，弃去上清液，尽量吸干残留乙醇，防止乙醇影响后续实验。

8、室温晾干RNA沉淀5-10分钟，待乙醇完全挥发后，加入适量无RNA酶水溶解RNA，用微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，确保OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，说明RNA纯度较高，可用于后续实验。

（二） 反转录

1、按照反转录试剂盒说明书，在无RNA酶的离心管中配制反转录反应体系RNA模板2μg、随机引物1μl、dNTP Mix 1μl、5×反转录缓冲液4μl、反转录酶1μl，用无RNA酶水补足至20μl。

2、轻轻混匀反应体系后，短暂离心使液体集中于管底。

3、将离心管置于PCR仪中，按照以下程序进行反转录反应：16℃ 15分钟，42℃ 30分钟，85℃ 5分钟，反应结束后，将cDNA产物置于-20℃保存备用。

（三） 荧光定量PCR

1、准备反应体系：在96孔PCR反应板中，依次加入SYBR Green荧光定量PCR预混试剂10μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、cDNA模板2μl，用无RNA酶水补足至20μl。为避免实验误差，每孔设置3个技术重复。

2、用封板膜将反应板密封，轻轻振荡混匀后，短暂离心使液体集中于孔底。

3、将反应板放入荧光定量PCR仪中，设置反应程序：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，40个循环；反应结束后，进行熔解曲线分析，从60℃升温至95℃，升温速率为0.5℃/s，以检测PCR产物的特异性。

四、实验结果分析

（一）原始数据获取

荧光定量PCR仪运行结束后，导出每个样本的Ct值（循环阈值），Ct值表示PCR反应过程中荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，Ct 值与初始模板量的对数呈线性关系，Ct值越小，说明初始模板量越多。

（二）数据分析方法

采用2^-ΔΔCt 法进行相对定量分析。首先，计算每个样本目标基因与内参基因GAPDH的ΔCt 值（ΔCt= Ct目标基因-CtGAPDH）；然后，以对照组的ΔCt平均值作为校准值，计算其他处理组的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组平均值）；最后，通过公式2^-ΔΔCt 计算各处理组目标基因相对于对照组的表达倍数变化。

（三）结果呈现

绘制柱状图展示不同药物浓度处理组与对照组相比，目标基因表达水平的变化情况。同时，运用统计学软件（如GraphPad Prism）进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并进行Tukey多重比较，判断不同处理组之间的差异是否具有统计学意义（P<0.05表示差异显著）。

五、实验结论

通过本实验，成功运用博清生物科技（南京）有限公司研发生产的荧光定量PCR仪检测了不同药物浓度处理下细胞中特定基因的表达水平变化。实验结果表明，随着药物X浓度的增加，目标基因的表达水平呈现出[上升/下降/先上升后下降等具体趋势]，且在[具体浓度]时，与对照组相比差异具有统计学意义。这一结果初步揭示了药物X对该基因表达具有[促进/抑制/双向调控等]作用，为后续深入研究药物作用机制提供了重要的实验数据支持。同时，本实验的操作流程和数据分析方法也为其他类似的荧光定量PCR实验提供了参考范例。